כרומטוגרפיית תמ"ג

אנו המעבדה היחידה בעולם הנותנת שירות לכרומטוגרפיית תמ"ג

למה צריכים כרומטוגרפיית תמ"ג?

ספקטרוסקופיית תמ"ג היא שיטה מעולה ובדרך כלל הכלי שנבחר לאפיון מדויק של מבני חומרים אורגניים וביומולקולות. תמ"ג היא השיטה המתאימה ביותר לניתוח של תרכובות טהורות. עם זאת, ספקרוסקופיית תמ"ג מוגבלת וכמעט חסרת תועלת במקרים שהם תרכובות שונות המכילות מבנים שונים מצויים בתערובת בתמיסה. ברוב הסינתזות האורגניות נוצרת תחילה תערובת של תרכובות שדורשת תהליך ההפרדה לפני איפיון המבני על ידי תמ"ג, דבר שלא תמיד אפשרית או קשה לבצע. לפיכך, נעשים מאמצים להשיג טכניקות משולבות כמו למשל התערובת מופרדת על ידי כרומטוגרפיה ואחר כך שימוש בתמ"ג על מנת לנתח כל רכיב.

יתרונות כרומטוגרפיית תמ"ג

במידה מסוימת, שיטות תמ"ג 2D ורב-מימדית יכולות להפריד תערובות פשוטות אך השיטה המתאימה ביותר היא להפריד את המרכיבים לפי מקדמי דיפוזיה שלהם. זו מושגת באמצעות טכניקות תמ"ג שמשדרות פולסים של גרדיאנטים מגנטיים באמצעות דיפוזיה-עצמית (SD), והצגת התוצאות כמפת קונטור 2D, כספקטרוסקופיה המסודר לפי דיפוזיה (DOSY). ההיסט הכימי של הספקטרום הוא על ציר אחד (בדרך כלל אופקי) וערכי מקדמי הדיפוזיה הוא על ציר השני (בדרך כלל הציר האנכי). כל מרכיב נותן ספקטרום חד-מימדי רגיל נפרד המתאים לקבוע דיפוזיה שלו. יישום זה של DOSY זכה לכינוי כרומטוגרפיית תמ"ג (תרשים 1). במאמרים האחרונים השתמשו במונח כרומטוגרפיית תמ"ג לספקטרום DOSY המצע עליו התרחשה ההפרדה הוא מובנה כגון סיליקה ג'ל לשיפר ההפרדה במימד הדיפוזיה. טכניקת כרומטוגרפיית התמ"ג אינה כרומטוגרפיה קלאסית מכיוון שאין פאזה בעל תנועה מכוונת. למרות שנעשה שימוש במונח "כרומטוגרפיית תמ"ג" במאמרים רבים, ייתכן שעדיף לקרוא לטכניקה "תמ"ג דמוי-כרומטוגרפי".

תרשים 1. כרומטוגרפיית תמ"ג חוסכת זמן וכסף משום שאין צורך להפריד את המרכיבים באופן פיזי

החיסרון העיקרי בשיטת, DOSY הקונבנציונלית הוא שברוב המקרים אין הפרדה מספיקה בציר הדיפוזיה בכדי להפריד את מרכיבי התערובת באופן מלא. דעיכת ההשראה הופשית (FID) של ניסוי DOSY הוא סכום של סינוסואידים דועכים במימד האיסוף וסכום של דעיכות גאוסיאניות במימד הדיפוזיה. מימד האיסוף מפוענך בקלות על ידי התמרת פוריה שמאפשרת הפרדה גבוהה בתחום התדר. עם זאת, ניתוח של מימד הדיפוזיה כרוך בהיפוך של ההמרת לפלס (ILT). למרות שהשיטה מדויקת עד 2% עבור דעיכה יחיד, מתקבלת הפרדה נמוכה מאוד במקרה של שניים או יותר סיגנלים חופפים כתוצאה מכן הסיכוי קלוש להפריד דיפוזיות ששונות בפחות מ-30-50%.

ניסיונות לשפר את ההפרדה במימד הדיפוזיה נעשות על ידי הוספת מצע כרומטוגרפי מוצק כגון סיליקה ג'ל. בכרומטוגרפיה קונבנציונלית, סיליקה ג'ל קושרת כל מרכיב באופן שונה, ומאפשרת העברה של כל מרכיב במהירות שונה בקולונה. כמו כן, קיימים הבדלים במהירות דיפוזיה של תרכובות למרות שאין זרימה. עם זאת, שימוש בטכניקות תמ"ג קונבנציונאליות עם סיליקה ג'ל מוצק מרחיבה את הסיגנלים הנובעים מהנוזל למאות או אלפי הרץ זאת בשל הסוספטביליות המגנטית הלא הומוגניות. סיגנלים הנובעים ממוצקים שמתגלגלים לאט, אם בכלל, מורחבים לעשרות קילוהרץ בשל האנאיזוטרופייה של היסט הכימי. DOSY דורש סיגנלים צרים בתמ"ג חד-מימדי כדי לתת סיגנלים בספקטרום הדיפוזיה. הסיבה לכך היא כי סיגנל רחב עובר רלקסציה כמעט מלאה במהלך רצף הפולסים של דיפוזיה לפני האיסוף. לכן, השתמשו בשיטות תמ"ג למצב מוצק סיבוב בזווית הקסם לרזולוציה גבוהה (HR-MAS) או התאמת סוספטיביליות של הממס לסיליקה כדי לקבל את הספקטרום. שיטה זו מאוד מסבכת את יישום טכניקה זו ומספקת תוצאות מוגבלות.

היתרונות של הפטנט עבור כרומטוגרפיית תמ"ג בננוטכנולוגיה נוזלית (תרשים 2) שפותחה על ידינו מעל סיליקה הן:

• שימוש בספקטרומטר תמ"ג רגיל עבור מצב נוזלי ללא גלאי HR-MAS או יכולת MAS.
• ללא צורך בממיסים עם סוספטיביליות גבוהה שהם הם בדרך כלל מכילים ברום או יוד הרגישים מאוד לאור.
• הדוגמה נמדדת בלי סיבוב ולכן קצב הדיפוזיה אינו מושפע מסיבוב.
• הננוטכנולוגיה הנוזלית שלנו יציבה במשך שנים ולכן אין צורך להכין את ה'ממס' מיד לפני השימוש.

תרשים 2. אמפולה של 'ממס' לכרומטוגרפיית תמ"ג

יישומי כרומטוגרפיית תמ"ג

ניסוי דיפוזיה רגילה או DOSY בדרך כלל נותן ההפרדה מוגבלת בתחום הדיפוזיה כפי שמוצג בתרשים 3 עבור התרופה, אדוויל, ב D₂O. השימוש בממס לכרומטוגרפיית תמ"ג משפרת את ספקטרום ה-DOSY מבחינת איכות ההפרדה בין מרכיבי התרופה (תרשים 4).

תרשים 3. ספקטרום DOSY של תרופת האדוויל. הספקרום מראה הפרדה פחותה. בכיוון הדיפוזיה (אנכי)

תרשים 4. ההפרדה של תרופת האדוויל, למרכיביו על ידי כרומטוגרפיית תמ"ג

נעשה שימוש בכרומטוגרפיית תמ"ג במגוון רחב של תערובות כולל תרופות (תרשים 5) ותערובות מתגובה. תוצאות כרומטוגרפיית התמ"ג הן שספקטרום ¹H מחולק לספקטרומים נפרדים. תרשים 5 מציג את הספקטרום עבור כל מרכיב של התערובת.

תרשים 5. ההפרדה של התרופה, דקסמול, למרכיביו על ידי כרומטוגרפיית תמ"ג

ניתן ליישם DOSY בשלושה או יותר מימדים עבור כרומטוגרפיית תמ"ג על ידי שילוב טכניקות דו-מימדיות כגון TOCSY עם הניסוי DOSY. תרשים 6 מציג את הספקטרום DOSY-TOCSY תלת-מימדי של דקסמול בממס לכרומטגורפיית תמ"ג.

תרשים 6. ספקטרום כרומטוגרפיית תמ"ג DOSY-TOCSY תלת-מימדי של דקסמול

כדי לראות את התרשים בתלת-מימד השתמש במסנן אדום לעין שמאל ומסנן ציאן לעין ימין.

מקורות מידע

• P. Hodge, P. Monvisade, G. A. Morris and I. Preece, "A novel NMR method for screening soluble compound libraries", Chem. Commun., 239-240 (2001).
• S. Caldarelli, "Procede d'analyse utilisant la RMN", Fr. Pat. 2847674 (2002).
• S. Viel, F. Ziarelli and S. Caldarelli, "Enhanced diffusion-edited NMR spectroscopy of mixtures using chromatographic stationary phases", PNAS, 100, 9696–9698 (2003).
• G. Pages, C. Delaurent, S. Caldarelli, "Investigation of the chromatographic process via pulsed-gradient spin-echo nuclear magnetic resonance. Role of the solvent composition in partitioning chromatography", Anal. Chem., 78 561–566 (2006).
• S. Caldarelli, "Chromatographic NMR: a tool for the analysis of mixtures of small molecules" Magn. Reson. Chem., 45, S48 (2007).
• R. E. Hoffman, A. Aserin, N. Garti, "System and methods for diffusion ordered spectroscopy", PCT Int. Appl. WO 2008050347 A2 (2008).
• R. E. Hoffman, H. Arzuan, C. Pemberton, A. Aserin and N. Garti, "High-resolution NMR "chromatography" using a liquids spectrometer", J. Magn. Reson., 194, 265 (2008).
• C. Carrara, S. Viel, F. Ziarelli, G. Excoffier, C. Delaurent and S. Caldarelli, "Chromatographic NMR in NMR solvents", J. Magn. Reson., 194, 303-306 (2008).
• J. S. Kavakka, I. Kilpeläinen, and S. Heikkinen, "General Chromatographic NMR Method in Liquid State for Synthetic Chemistry: Polyvinylpyrrolidone Assisted DOSY Experiments", Org. Lett., 11, 1349-1352 (2009).
• R. E. Hoffman, C. Pemberton, A. Aserin, N. Garti, "NMR Chromatography using nano-structured liquids", PCT Int. Appl., WO 2010023673 (2010).
• R. E. Hoffman and R. Shenhar, "Polymer, copolymer and oligomers and uses thereof for NMR Chromatography in homogeneous solutions", patent pending (2010).
• C. Pemberton, R. E. Hoffman, A. Aserin and N. Garti, "New insights into silica based NMR "Chromatography"", J. Magn. Reson., in press (2011).
• C. Pemberton, R. E. Hoffman, A. Aserin and N. Garti, "NMR chromatography using ...", in preparation.
• C. Pemberton, "NMR chromatography using silica and dispersed systems", Thesis to the Hebrew University in preparation.