TOCSY

ספקטרוסקופיית הקישוריות הכוללת (TOCSY) הידועה גם בשם HOHAHA (הארטמן האן הומוגרעינית - על שמות החוקרים שפיתחו את השיטה) מאפשרת להפריד סיגנלים של פרוטונים לתת קבוצות המהוות רשת שבה כל הפרוטונים מצומדים בינהם. היא יעילה במיוחד כאשר המולטיפלטים חופפים (נמצאים בהיסטים כימיים מאוד קרובים) וכאשר ישנו צימוד חזק מסדר שני. ספקטרום TOCSY מראה התאמה דרך צימודי ספין–ספין לפי ההתאמה אפשר לראות רשת צימוד שעצמת הסיגנל לא תלויה באופן ישיר במרחק הקשרים שבין הסיגנלים השותפים ולכן הסיגנל במרחק של חמישה קשרים עשוי להיות בעצמה חזקה או חלשה מהסיגנל במרחק של שלשה קשרים. TOCSY, היא שיטה המשמשת בדרך כלל למדידה של מולקולות גדולות כגון פפטידים חלבונים ואוליגוסכרידים ופוליסכרידים. כאשר מחפשים את המרחק במספר קשרים בין פרוטונים, כדי לקבוע את הסדר שבו הפרוטונים קשורים ביניהם עדיפה שיטת COSY.

סדרת הפולסים (תרשים 1) המשמשת בניסוי TOCSY במעבדה שלנו היא מוגברת מפלים (גרדיאנטים) כלומר במהלך סדרת הפולסים הראשית מופעלים גם סדרת הפולסיםמפלים מגנטיים בערוץ מקביל. בערוץ הראשי מופעלת סדרת פולסים המזכירה סדרת פולסים של ניסוי COSY אלא שבזמן ההתפתחות מופעלת נעילת ספין (spin-lock) על ידי הפעלת פולסים מורכבים למשך 20 עד 200 מילישניות בעוצמה שמספיקה לכסות את רוחב פס הספקטרום. המטרה בנעילת ספין היא להשאיר את וקטור המגנטיזציה במישור x-y ואז מתאפשרת האינטרקציה בכל מערכת הספינים המוצמדת. משך הזמן שבו מופעלת נעילת הספין קובע את מרחק הקשרים הניתן למדידה, ככל שהוא ארוך יותר המרחק גדול יותר וככל שהוא קצר המרחק קטן יותר. אבל נעילת ספין ארוכה מדי עלולה לחמם את הדוגמא ולגרום נזק לרכיבים אלקטרוניים בספקטרומטר, לכן יש להתחשב במגבלה זו.

ההנחתה צריכה להיות שרוחב פולס של 90ο יהיה קטן מרבע רוחב הפס הספקטרלי. בדרך כלל רוחב הפולס הוא שישית מרוחב הפס הספקטרלי. לדוגמה הנחתה של 12 db עם מגבר של 50W יוצרת פולס ברוחב של כ-μs 35.

תרשים 1. סדרת פולסים עבור TOCSY עם גרדיאנטים

ספקטרום ה-TOCSY (תרשים 2) של אתילבנזן (תרשים 3) מכיל אלכסון שעליו ספקטרום חד מימדי שבו אלכסון וסיגנלי חתך. האלכסון מכיל את הספקטרום החד מימדי שהסיגנלים שבו דוכאו. סיגנלי החתך מעידים על צימוד בין המולטיפלטים וכאשר הם קיימים ניתן לראות התאמה וקישוריות בין המולטיפלטים השונים. הבולט בין סיגנלי החתך הוא בין H1' ל-H2' ב-2.65ppm ו-1.25 ppm. הסיגנלים הרצויים (כאלה שמבטאים קישוריות) נמצאים בפאזה טהורה עם עיוות קל. רעשים (סיגנלים לא רצויים) מופיעים כפסים אנכיים במקומות מוגדרים ובדרך כלל לא נמצאים באותה פאזה.

בספקטרום ה-COSY (,raho 2) ישנם סיגנלים לאורך האלכסון, וישנם סיגנלי חתך (סיגנלים שלא על האלכסון וישנו לפחות סיגנל אחד נוסף שנמצא באותו חתך רוחב או חתך גבוה שלהם). סיגנלי החתך מעידים על צימוד בין מולטיפלטים בשל קישוריות במרחק של עד שלושה, או אפילו ארבעה, קשרים. האלכסון מורכב מסקטרום החד מימדי ללא סינגלטים. הסיגנל החתך הבולט ביותר בספקטרום (תרשים 2) של אתילבנזן (תרשים 3) הוא בין פרוטון H1' לפרוטון H2' ב-2.65 חל"מ ל-1.24 חל"מ. קישוריות חלשה הרבה יותר של ארבעה קשרים (ראה תרשים למטה) מופיעה בין H1' לH2- ב-2.65 חל"מ ו-7.2 חל"מ. כל הסיגנלים הרצויים נמצאים במופע הפוך (אנטי פזה) של פאזה, כלומר, חצי מהמולטיפלט חיובי וחצי שלילי. בנוסף מופיעים סיגנלים לא רצויים (תרשים 4) המופיעים כפס לאורך ציר ה-y. בנוסף אם נצייר V דמיוני הפוך שקודקודו בציר העליון של הספקטרום יופיעו. רעשים אלו אינם באותו מופע של הסיגנלים הרצויים בדרך כלל ומופיעים באזורים מסוימים.

תרשים 2. ספקטרום TOCSY דו מימדי של אתילבנזן

תרשים 3. המבנה המולקולארי של אתילבנזן

תרשים 4. סיגנלים לא רצויים בספקטרום TOCSY של אתילבנזן

ספקטרום פרוטון חד-מימדי של המולקולה דיטרטבוטילבנזוקריסן (תרשים 5) נותן פענוח חלקי בלבד. מספקטרום TOCSY (תרשים 6)של המולקולה ניתן לראות חלוקה ראשונית של הפרוטונים לארבע קבוצות של רשתות פרוטונים מצומדות. הפרוטנים של הטרטבוטילים(ב-0.92 ו-1.40 חל"מ) אינם מראים התאמה משום שהם רחוקים מדי מהטבעות הארומטיות.

תרשים 5. המבנה המולקולארי של 12,14-דיטרטבוטילבנזוקריסן

תרשים 6. ספקטרום TOCSY דו-מימדי של 12,14-דיטרטבוטילבנזוקריסן

באזור הארומטי (תרשים 7) ניתן לראות את כל ההתאמות ברשתות הצימוד השונות. שלא כב-COSY לא ניתן לקבוע שכנויות בין פרוטונים על סמך הקישוריות. לדוגמה סיגנל הפרוטון ב- 8.62 חל"מ קרוב לסיגנל ב-7.55 חל"מ אך ההתאמה ביניהם חלשה מההתאמה לסיגנל ב-7.59 שנמצא במרחק של ארבעה קשרים. וזו חלשה אף יותר מההתאמה לסיגנל במרחק של חמישה קשרים ב-8.59 חל"מ.

תרשים 7. האזור הארומטי בספקטרום דו מימדי מסוג TOCSY של 12,14-דיטרטבוטילבנזוקריסן

שימוש בקווים אנכיים ואופקיים מאפשר להפריד את הסיגנלים של הפרוטונים השונים לקבוצות על פי הקישוריות שלהם (תרשים 8). הקבוצה הכחולה שבה ארבעה פרוטונים מורכבת מהסיגנלים ב-8.62, 7.55 ,7.59 ו-8.56 חל"מ. הקבוצה הירוקה שבה חברים ארבעת הסיגנלים ב-8.17, 7.34, 7.44 ו-8.45 חל"מ והקבוצה האדומה בה חברים שני פרוטונים שהסיגנלים שלהם מופיעים ב-7.76 ו-8.32 חל"מ ולפי קבוע הצימוד של 8.9 הרץ ביניהם המתאים לצימוד במרחק של שלשה קשרים ניתן לקבוע שמדובר ב-H10 ו-H9. הקבוצה הצהובה בה חברים שני פרוטונים ומדובר ב-H11 ו-H13 זאת בהסתמך על קבוע הפיצול הקטן (1.9 הרץ) המתאים לצימוד במרחק של ארבעה קשרים.

תרשים 9. האזור הארומטי בספקטרום דו מימדי מסוג TOCSY של 12,14-דיטרטבוטילבנזוקריסן בחלוקה לקבוצות פרוטונים על פי הצבעים השונים