התאמה בין-גרעינית לטווח קצר

התאמה בין-גרעינית משמש לפענח את הספקטרום של גרעין אחר אחרי שספקטרום של גרעין אחד ידוע. זה יכול לעזור לפענוח ספקטרום של שני גרעינים גם כאשר יש רק פעינוח חלקית של אחד או שניהם. עבור מולקולות קטנות, ¹H הוא בדרך כלל מוצאם עם ¹³C ועבור ביומולקולות, נוהגים גם להמתאים ¹H עם ¹⁵N. ניתן לקבל התאמות עם גרעינים אחרים כגון ²⁹Si הניסוי עשויה גם לספק מידע כימי אשר הספקטרום של הגרעין לא יכול לספק לבד. בעקרון, התאמה בין-גרעינית ניתן לבצע באמצעות רצף שני פולסים (תרשים 1) וניתן לצפות בערוץ שאינו פרוטון (X) . עם זאת, הרגישות שופרה מאוד ע"י שיטות שונות כולל INEPT כפול, גילוי הפוך, בחירת ע"י גרדיאנט והפרת צימוד. כתוצאה מכך, אחת מגוון רחב של סדרות פולסים יתאים יותר עבור יישום מסוים משמש במקום רצף של שתי פולסים בתרשים 1.

תרשים 1. סדרת פולסים עבור התאמה בין-גרעינית בסיסית

כאן נדון את הסוג של הניסוי עבור צימוד בין-גרעיני קצר-טווח גדול אשר בדרך כלל נובעים מאינטראקציות חד-קשריות, למשל, ¹H-¹³C או ¹H-¹⁵N. התאמה בין גרעינית ארוכת טווח נדון במקום אחר. ישנם שבעה סדרות פולסים המתאימות לצורך הניסוי הזה כי הם המתאימים ביותר עבור תנאים שונים: HSQC (עקביות חד-קוונטית ביון-גרעינית), HSQCSI (עקביות חד-קוונטית ביון-גרעינית עם רגישות משופרת), HSQCSIsp (HSQCSI עם פולס אחד בצורת נוספת), HSQCSIsp2 (HSQCSI עם שני פולסים בצורת), HMQC (עקביות רב-קוונטית ביון-גרעינית), HMQCSIsp (עקביות רב-קוונטית ביון-גרעינית עם רגישות משופרת ופולס בצורה) ו- HMBC לטווח קצר (התאמה רב-קשרי ביון גרעיני מותאם לטווח קצר).

את הסדרה הטובה ביותר עבור העבודה במולקולות קטנות היא גם המסובך ביותר: HSQCSIsp2 (תרשים 2). זה מבוסס על סדרת HSQC עם תוספת של מסלול קוונטי שני לשיפור הרגישות (SI) ופולסים בצורה כדי לשפר את נקיון של המופע אבל לוקח זמן רב יותר ומאפשר אובדן הסיגנל בשל הרפיה ומדכא 'הפרעה השימושי'. לכן, צריך ליישם את שיפור הרגישות רק אם רוחב סיגנל ה-¹H פחות מ 20 הרץ עבור ¹H-¹³C ו-12 הרץ ¹H-¹⁵N. שים לב כי רוחב סיגנל ה-¹⁴NH הוא בדרך כלל רחב יותר מאשר זה של ¹⁵NH שבו צורך להחליט איזה טכניקה להשתמש. ניתן למדוד את רוחב סיגנל ה-¹⁵NH מלווייני ה-¹⁵N של סיגנל ה-NH. אם את רוחב הספקטרום ¹³C הוא פחות מ-60 חל"מ או עבור ¹⁵N רוחב הספקטרום פחות מ-90 חל"מ או רוחב סיגנל ה-¹H עולה על המתאים לשיפור רגישות, תוספת של פולסים בצורת אינו משפר את הספקטרום מספיק כדי להתגבר על הפסדים ברגישות. רק זוג אחד של קטניות בצורת יש להחיל אם 1H-רוחב הקו הוא גדול מ-10 הרץ.

תרשים 2. סדרת פולסים על בסיס HSQC

הסידרה כפי שמצויר היא של HSQCSI. יש להשמיט את הרכיבים בצבע שמיים כחולים עבור HSQC. יש להשתמש בפולסים בצורה עבור שני הפולסים ה-°180 של X הראשונים עבור HSQCSIsp וכל הפולסים ה-°180 של X עבור HSQCSIsp2. פרמטרים עבור סדרת הפולסים מפורטות בטבלה 1.

אם ההפרדה הדיגיטלית ללא מילוי אפסים של הספקטרום ב-‎f₁‏ (¹³C, ¹⁵N,וכו') הוא גס מ-8 הרץ HMQC (תרשים 3) נותן רגישות רבה יותר מאשר HSQC. אם ההפרדה ב-f₂ (בכיוון ה-¹H) היא פחות מ-10 הרץ לצורך ¹H-¹³C או 6 הרץ לצורך ¹H-¹⁵N יש להשתמש ב-HMQCSIsp.

תרשים 3. סדרת פולסים של HMQC

יש להשתמש ב-HMBC רק כמוצא אחרון, כאשר רוחב קו ¹H גדול מ-40 הרץ עבור ¹H-¹³C ו-30 הרץ עבור ¹H-¹⁵N)

Δ צריך להיות 1/(4J_AX) כאשר J_AX הוא קבוע הצימוד. עבור הצימוד ¹H-¹³ קבועים כ-125 הרץ עבור sp₃ ו-160 הרץ עבור sp₂ (טבלה 1). עבור הצימוד 1¹H-¹⁵N קבועים כ-80 הרץ. מעוצמת הגרדיאנט m לא צריכה להיות כפולה פשוטה של עוצמות הגרדיאנטים האחרים.

הסיגנלים עבור התאמה לטווח קצר (חד-קשריים) הם במופע חיובי טהור עבור כל הניסויים למעט HMBC לטווח קצר HMBC (ראה תרשים עבור התאמה ארוכי טווח) שיש מבנה מופע מורכב ב-f₂ ועיבודו הטוב ביותר הוא גודל בכיוון הזה.

הניסוי התאמה אינו מכיל אלכסון, בניגוד לניסויים הומוגרעיניים. כל סיגנל של פרוטון הוא עובר התאמה עם סיגנל של פחמן. לדוגמה בספקטרום (תרשים 4) H2' של אתילבנזן (תרשים 5) ב-1.24 חל"מ עובר קורלציה עם C2'ב-15.69 חל"מ ו-H1' ב-2.65 חל"מ עובר קורלציה עם C1' ב-28.97 חל"מ. הסיגנלים בספקטרום החד-מימדי שאינם עוברים קורלציה אינם מופיעים בספקטרום הדו-מימדי.

תרשים 4. ספקטרום 2D HSQCSI של אתילבנזן

תרשים 5. מבנה של אתילבנזן

ניסויי קורלציה בין-גרעיניים סובלים בהפרעות t₁ שמופיעים כמו פסים אנכיים בספקטרום. בנוסף HSQCSI סובל מ'הפרעה שימושית' (תרשים 6) שבו התאמות חלשים נתפסים מופיעים לפרוטונים מצמידים לפרוטון המחובר לפחמן. זה יכול להיות שימושי כאשר יש חפיפה חזקה בספקטרום פרוטון המאפשר להשתמש בפיזור היסט הכימי של ה-¹³C. השימוש בפולסים עם צורה מונע הופעת 'ההפרעה השימושית' לכן עם רוצים לראות את 'ההפרעה השימושית' להשתמש בפולסים קשים. דוגמה לשימוש ב'הפרעה שימושית ראה את הפענוח של כולסטריל אצטט.

תרשים 6. ספקטרום 2D HSQCSI של אתילבנזן המראה את 'ההפרעה השימושית'

ניתן למדוד את קבוע הצימוד ¹H-¹³C אם מפרים את צימוד (תרשים 7). היתרון בזה על ספקטרום פחמן חד-מימדי מצומד הוא שהדובלטים אינם חופפים.

תרשים 7. ספקטרום מצומד 2D HSQCSI של אתילבנזן

הספקטרום הקורלציה HQSCSI (תרשים 8) של 12,14-דיטרטנוטילבנזו[g]כריסן (תרשים 9) מפריד באופן ברור בין אזורים אליפטיים וארומטיים. מהספקטרום הפרוטון, הפחמנים המצומדים לפרוטון בספקטרום הפחמן משוייכים, החל מהטרטבוטילים. הפענוך שלהם ההנחה כי ^tbu14 שוייך לסיגנל רחב יותר ל-^tbu12. הספקטרום HMQC (תרשים 10) נותן את אותה תוצאה אך חלשה מעט יותר בגלל הההפרדה ב-f₁ אינה נמוכה.

תרשים 8. ספקטרום 2D HSQCSI של 12,14-דיטרטנוטילבנזו [g] כריסן

תרשים 9. המבנה של 12,14-דיטרטנוטילבנזו [g] כריסן

תרשים 10. ספקטרום 2D HMQC של 12,14-דיטרטנוטילבנזו [g] כריסן

ההפרדה ב-¹³C הוא הגורם המגביל בשני ספקטרומים הנ"ל. ניתן לפתור את הבעיה באמצעות איסוף ספקטרום בטווח מוגבל ב-¹³C (תרשים 11). עם זאת, סיגנלים שנופלים מחוץ לאזור העניין מקופלים, ואינם במופע, ויכולים להיות לא מופרי צימוד לגמרי בכיוון אופקי ולכן יש רגישות מופחתת. עם זאת, ההפרדה בכיוון האנכי (f₁) משופר באופן דרמטי מבלי להגדיל את זמן האיסוף.

תרשים 11. ספקטרום 2D HSQCSI של 12,14-דיטרטנוטילבנזו בטווח מוגבל [g] כריסן

ניתן להשתמש באזור ארומטיים (תרשים 12) לאחר מכן כדי לפענח את כל הפחמנים קשורים לפרוטון.

תרשים 11. אזור הארומטי של ספקטרום 2D HSQCSI של 12,14-דיטרטנוטילבנזו [g] כריסן

את קבועי הצימוד הבין-גרעיניים ניתן למדוד מספקטרום ה-HSQCSI המצומד (תרשים 13).

תרשים 13. ספקטרום 2D HSQC מצומד של 12,14-דיטרטנוטילבנזו [g] כריסן

משתמשים ב-HMBC לטווח קצר לסיגנלים רחבים רחבה שאחרת ידעיכו לתוך הרעש במהלך סידרת הפולסים. הספקטרום לא נותן מופע טהור ואינו מופר צימוד ב-f₂. תרשים 14 מציג את HMBC לטווח קצר של גרמיצידין (תרשים 15) אף שהסיגנלים שלה צרים מספיק כדי להשתמש HSQCSIsp2 רגיל.

תרשים 14. ספקטרום HMBC לטווח קצר מצומד של גרמיצידין

תרשים 15. המבנה של גרמיצידין

ניתן ליישם HSQC ב-¹H-¹⁵N באותה דרך כמתואר לעיל עבור ¹H-¹³C. תרשים 16 מציג את ספקטרום HSQCSIsp2 ¹H-¹⁵N של גרמיצידין.

תרשים 16. ספקטרום ¹H-¹⁵N HSQCSIsp2 של גרמיצידין