תמג חנקן (N)

לחנקן יש שני גרעיני תמ"ג פעילים  (תרשים 1). ¹⁵Nנותן קווים חדים אבל הוא מאוד לא רגיש.  ¹⁴Nהוא גרעין בעל רגישות בינונית אבל אותות שלה מתרחבים באופן משמעותי בדרך כלל על ידי אינטראקציות ארבע-קוטביות לפעמים עד כדי כך הם לא ניתנים לצפייה בספקטרומטר תמ"ג להפרדה גה.

תרשים 1. השוואה של ספקטרומים  ¹⁴N ו-¹⁵N של אוריאה. אות ה-¹⁴N מאוד רחב כי הוא ארבע-קוטב.

ניתוח אופייני של ספקטרום תמ"ג חנקן מורכב מהתאמת היסטים כימיים צפוים (תרשים 2) לקבוצות פונקציונליות צפויות. שירות התמ"ג שלנו מספק תמ"ג ¹⁴N ו-¹⁵N יחד עם שיטות תמ"ג רבות אחרות. כל סוג של אות בעל טווח היסט כימי אופייני שיכול לשמש לפענך. טווחי היסט הכימי זהים עבור שני איזוטופי חנקן. IUPAC ממליץ CH₃NO₂ (90%) ב-CDCl₃ כתקן היסט כימי לשני הגרעינים (¹⁴N ו-¹⁵N). עם זאת, רוב המומחים בספקרוסקופיה מייחסים ספקטרה חנקן ל-NH₃ נוזלי ו-IUPAC ממליץ עליו כתחליף עבור ¹⁵N. כאן, היסטים הכימיים מיוחסים ל-NH₃ נוזלי (בלחץ) ב-‎25°C‌ למרות שזה נגד המלצות IUPAC עבור ¹⁴N. כדי להמיר היסטים כימיים של ¹⁵N אל תקן IUPAC ה-CH₃NO₂, יש לחסר 380.5 חל"מ ועבור ¹⁴N, יש לחסר 381.6 חל"מ.

תרשים 2. טווחי היסט כימי של חנקנים לפי הסביבה הכימית שלהם

בחר את המבנה הזה צמוד ביותר מייצג את החנקן הנדרש.

תמ"ג ¹⁴N

ניסוי תמ"ג ה-¹⁴חנקן חד-מימדי הוא הרבה פחות רגיש מאשר פרוטון (¹H) אבל יש טווח היסט כימי הרבה יותר גדול. האותות שלו הם הורחבו על ידי אינטראקציות ארבע-קוטביים. ככל שהמולקולה גדול יותר וככל הסביבתה של החנקן פחות סימטרי, כך האות יותר הרחב. לפיכך, יון האמוניום המימית הקטן והמאוד סימטרי נותן קו חד מאוד (תרשים 3), פחות הרץ אחד רחב. אות אמוניה נוזלי, בהיותה פחות סימטרית, היא 16 הרץ רחב (על ספקטרומטר 400 MHz בטמפרטורת החדר). האוריאה הוא גדול ולא סימטרית לכן רוחב הקו הוא כ-1 קילוהרץ. מולקולות שהן באופן משמעותי גדול יותר אוריאה מניבות אותות רחבות מכדי להיראות עם ספקטרומטר תמ"ג ברזולוציה גבוהה. עם זאת, טווח היסט הכימי של חנקן הוא רחב ולכן ניתן להשתמש בקלות להבחנה מינים שונים של חנקן עבור מולקולות קטנות מאוד.

תרשים 3. השוואה בין קו רוחב ¹⁴N אותות. כל עוד המולקולה גדול יותר ופחות סימטרי, כך האות רחב יותר.

צימוד בין-גרעיני הוא נדיר עם 14Nבגלל התרחבות ארבע-קוטבית. ניתן להבחין בה בפרוטונים שח יון אמוניום (תרשימים 4, 5) בטמפרטורת החדר ואמוניה נוזלי בטמפרטורות נמוכות. אותות ניטרילים של פחמן ופרוטוני NH הם מורחבים לעתים קרובות על ידי צימוד שיורית ל- 14N.

תרשים 4. ספקטרום ¹H בשכיחות טבעית של (‌NH₄Cl 1.5 M)‏ ב-1M HCl/H₂O מראה צימוד ל-¹⁴N כטריפלט (ספין 1) צימוד עם ¹⁵N כדובלט חלש. שים לב שקבוע הפיצול של ¹⁴N קן מזה של ¹⁵N בגלל התדר הנמוך יותר של ¹⁴N.

תרשים. 5. NH₄Cl (1.5 M) ב-1M HCl/H₂O שמראה צימוד ל-¹H כקוינטט בגלל נוכות ארבע פרוטונים בצורת צימוד AX₄.

תכונות ¹⁴N

(הסברים נוספים)

חזרה לראש העמוד

¹⁵N NMR

הניסוי תמ"ג החד-מימדי של ¹⁵חנקן הוא הרבה פחות רגיש מאשר פרוטון (¹H) ו-¹³פחמן. כתוצאה מכך, רק לעתים נדירות ¹⁵חנקן הוא רגיש מספיק וצריך להשתמש השלכה של המתאה בין-גרעינית (טווח קצר וטווח ארוך) כדי לשפר את הרגישות (תרשים 6). על מנת לקבל המתאה בין-גרעינית בטווח קצר, פרוטוני ה-NH חייבת להיות במצב של חילוף איטי ולא מותמרים בדוטריום. זה מונע שימוש בממסים כגון D₂O אלכוהול. מנהג נפוץ בביוכימיה הוא או להשתמש בממסים שאינם מחליפים כגון DMSO-d₆ או 1:9 D₂O/H₂O בשילוב עם טכניקות הדעכת מים. התאמה בין-גרעינית ארוך טווח מחייבת אותות פרוטון מאוד חדות של כשניים או שלושה קשרים שלמעשה מגביל את רוחב הקן של פרוטון ל-3 הרץ אבל יש את היתרון של לא דורש נוכחות של אותות חדות של NH עצמו.

תרשים 6. ספקטרום תמ"ג ¹⁵N של ציקךוספורין (A (25mM ב-DMSO-d₆ הנובע מהשלכה של התאמה בין-גרעינית. הספקטרום האדום העליון כולל חנקנים הקשורים ישירות למימן. הספקטרום האדום התחתון כולל סיגנלים חלשים מהתאמות רב-קשרי ומדכה חנקנים שאין להם התאמות רב-קשריות.

ניסוי תמ"ג החד-מימדי של ¹⁵חנקן נותן קווים צרים בטווח גדול של היסט כימי. השכיחות הטבעית נמוכה (0.37%) ועושה את הרגישות הנמוכה שלו אפילו יותר גרוע לכן הוא מועשר לעתים קרובות עבור תמ"ג.

פענוח אופייני של ספקטרום תמ"ג ¹⁵N מורכב התאמה היסטים כימיים צפויים למינים צפויים. דוגמה פשוטה היא של אזיד הנתרן (תרשים 6) שבו החנקן במרכז יש היסט כימי שונה מהחנקנים בקצים.

תרשים 6. ספקטרום תמ"ג ¹⁵N של אזיד הנטרן (1M) ב-D₂O

תחליף לשימוש בריכוזים גבוהים הכרח למולקולות גדולות הוא להעשיר עם ¹⁵N. עם זאת, זה מאוד יקר ואת עלות הכנת הדוגמה בתרשים 7 הוא כמה אלפי דולרים.

תרשים 7. ספקטרום תמ"ג ¹⁵N של פרוטיאז HIV-1 מועשר.

הפרת צימוד גורמת ל-NOE שלילית, מפחיתה או הופכת את האות (תרשים 8). כדי למנוע זאת, ניסוי ה-DEPT או השהיות לרלקסציה ארוכות מאוד של דקות או יותר נדרשות.

תרשים 8. ספקטרום תמ"ג ¹⁵N עם הפרת צימוד של פרוטיאז HIV-1 מועשר המראה היפוך האות כתוצאה מ-NOE שלילי. האות בצד ימין אינו קשר לפרוטון ואינו נהפך.

צימוד בין-גרעיני נראה בפרוטונים. צימוד חד-קשרי הם בסדר גודל של 90 הרץ צימוד קטנים יותר דרך 2, 3 ו-4 קשרים נצפו. במקרים מסוימים, ניתן להבחין באותות הלוויין חלשות מאוד בספקטרום של ¹H אותות NH (תרשים 9), וניתן להשתמש בן כדי לאשר את הפענוך של אותות ה-NH.

תרשים 9. ספקטרום ה-¹H של אוריאה בשכיחות טבעית (5 mM) ב-DMSO-d₆. האות מראה התרחבות הנובעת מצימוד שיורית ל-¹⁴N ולווינים המצמידים ל-¹⁵N. הלוויינים בשילוב עם הרחבת האות הראשי הם סימן טוב לאות NH בספקטרום ¹H.

¹⁵N DEPT

ניתן לשפר את הרגישות של של ¹⁵N באמצעות ניסוי DEPT (תרשים 10), אולם, החקנים שלא קשורים לפרוטונים מודחקים.

תרשים 10. ספקטרופ ¹⁵N DEPT של פרוטיאז של HIV-1 מועשר. הניסוי הרבה יותר רגיש וניתן לאסוף אותו מהר יותר אבל רק חקנים קשורים לפורטונים מופיעים.

תכונות ¹⁵N

(הסברים נוספים)

בטיחות

הערה בטיחות: חלק מהחומרים שהזכרנו כאן הם מאוד מסוכנים. תשאל כימאי מוסמך לעצה לפני הטיפול בהם. כימאי מוסמך צריך לבדוק את הבטיחות ספרות רלוונטית לפני הטיפול או מתן ייעוץ על חומרים מוכרים. ממיסי תמ"ג רעילים ורובם דליקים. באופן ספציפי, אמוניה היא רעילה הנוזל בלחץ בטמפרטורת החדר: יש לעבוד במנדף. אשלגן חנקתי עלולה להיות רעילים: להשתמש בכפפות מגן.