אזהרת בטיחות חלק מהפעולות המתוארות להלן עלולות להיות מסוכנות. אם אינך מכיר/ה את הוראות הבטיחות אנא התייעץ עם מנהלי המעבדה. או עם כימאי מוסמך.

דוגמאות לשירות מלא צריכות להתמוסס טוב באחד מהממסים המבוקשים. אם לא מבוקש שירות מלא אנא הכן את הדוגמא בדרך המתוארת להלן. לדוגמאות למצב מוצק, קשה למחצה וכרומטוגרפיית תמ"ג רק ניתן שירות מלא. ניתן להביא דוגמאות מוכנות לשירות במצב נוזלי בלבד.

מבחנות תמ"ג

את הדוגמאות לתמ"ג יש לשלוח במבחנות יעודיות למדידות תמ"ג בקוטר 5 מ"מ.

בחר מבחנה מתאימה למדידה. ל-400 ו-500 מגהרץ מבחינות באיכות וילמד 528-PP-7 אולדריץ Z412848, נורל NOR508UP7 או קונטס רמה 6 (235) מתאימות. (עבור תמ"ג בור השתמש בוילמד 528-PP-QTZ אם סיגנל הבסיס מהמבחינה מהווה בעיה.) אם הדוגמה ממיס זכוכית (למשל HF) השתמש בתותב טפלון או מבחינת קֶל-אֶף.

מומלץ לסמן את המבחנה במדבקה שתקיף את קוטר המבחנה ולא תבלוט לצדדים כפי שמובא בתרשים 1. כל סימון אחר עלול להעלם או להפריע לכניסת המבחנה אל המגנט.

ממסים

מכיון שאין לנו אפשרות למדוד ספקטרום תמ"ג במצב מוצק הדוגמאות חייבות להישלח בתמיסה. בבחירת הממס יש להתחשב במספר שיקולים.

• מומלץ מאוד להשתמש בממס מותמר דוטריום משתי סיבות.
  1. סיגנל הדוטריום משמש לנעילת התדר של השדה המגנטי ועל ידי כך משפר את הרזולציה של המגנט.
  2. ממסים רגילים הבליעות הרחבות של המימנים של הממס מכסות לעיתים את הבליעות של החומר אותו רוצים למדוד. כאשר משתמשים בממס מותמר דוטרים תופעה זו כמעט נעלמת.
• החומר צריך להתמוסס טוב (תרשים 2) בממס הנבחר. למדידת תמ"ג ¹H רצוי להמיס בין 2 מ"ג ל-10 מ"ג של חומר ב-0.6-1 מילילטר של ממס כך שגובה התמיסה במבחנה יהיה כ-4.5 סנטימטר (תרשים 3). עבור חומרים בעלי משקל מולקולרי גבוה יתכן שיהיה צורך להגדיל את ריכוז התמיסה. ריכוזים גבוהים מדי עלולים להוריד רזולציה בגלל ריויון ועליה בצמיגות החומר. למדידת תמ"ג ¹³C מומלץ להשתמש בתמיסה מרוכזת פי חמש (10 מ"ג-50 מ"ג). ניתן למדוד ספקטרום גם במקרים בהם אין מספיק חומר אלא שמומלץ לציין זאת ולבקש לבצע את המדידה במכשיר בתדר 500 מגהרץ. מדידה כזו תארך זמן רב יותר ויש לקחת שיקול זה בחשבון, בדרך זו נמדד ספקטרום ¹H עם פחות מ-0.1 מ"ג- חומר וספקטרום ¹³C עם פחות מ-1 מ"ג של חומר.

  תרשים 2. אם הדוגמה אינה צלולה מכל סיבה שהיא כמו מסיסות נמוכה, יצא ספקטרום גרוע

  

  תרשים 3. עומק הדוגמה אמור להיות בין 4.5 ו-5 ס"מ

  
• על מנת לקבל את הרזולציה הטובה ביותר שאפשר יש לבחור ממס בעל צמיגות נמוכה. יש לדעת שדרישה לרזולציה גבוה קשה ומאריכה במידה ניכרת את זמן המדידה, לדוגמא שימוש בממס דיאתיל אתר-d₁₀ מאפשר מדידה של סיגנלים חדים אך אורכת זמן יותר משימוש ב-DMSO-d₆.
• מחיר הממס, D₂O ו-CDCl₃ זולים ונותנים תוצאות מספקות ברב המקרים.
• בגלל שהתמרת מימני הממס אינה מושלמת יש סיגנלים של מימנים שמקורם בממס, לעיתים הם נמצאים באותו היסט כימי של המימנים בחומר הנמדד. יש לקחת עובדה זו בחשבון כאשר בוחרים ממס.
• כאשר מודדים תמ"ג בטמפרטורה משתנה יש להתחשב בטווח הטמפרטורות בהן הממס נמצא במצב נוזלי. קיימות שיטות להורדת טמפרטורת הקיפאון וכן יש שיטות למדידה בטמפרטורות שמעל נקודת הרתיחה.

ניקיון

לאחר שנבחר הממס והמבחנה יש להקפיד שהממס, המבחנה, מכסה המבחנה וכל גורם שנוגע בחומר הנמדד יהיה נקי. בדרך כלל שטיפת המבחנות במים או אצטון בשוטף מבחנות תמ"ג (תרשים 4) ואחר כך ניקוי במקל עם צמר גפן (תרשים 5) יכול להספיק. לא כדאי להשתמש במברשת או בחומרים מאכלים בגלל שהם פוגעים באיכות המבחנה ולמורידים את הרזולציה. לעיתים יש צורך בשטיפה יותר יסודית, כאשר הדוגמא רגישה מאוד לשאריות של אבק או כשהמבחנה מאוד מלוכלכת, ואז ניתן להשרות את המבחנה בתמיסה של חומצה סולפהכרומית. לפרק זמן שבין חצי שעה עד יומיים (נדרשת זהירות רבה מדובר בחומצה חזקה!). לאחר ההשרייה חשוב לשטוף את המבחנה לפחות שבע פעמים במים מזוקקים כדי להיפטר משאריות פארהמגנטיות שבתמיסת החומצה. יש לייבש את המבחנה על צידה בתנור בטמפרטורה של עד 150°C למספר שעות ולהוציא את המבחנה כשעה לפני השימוש.

סינון הדוגמא

חשוב מאוד שתמיסת הדוגמא תהיה צלולה, ניתן לסנן את הדוגמא במקרים בהם היא מכילה שאריות אבק או זיהומים שונים. הכן מעט יותר תמיסה מהנדרש, דחס צמר גפן לפיפטת פסטר ושטוף (את הפיפטה) עם ממס (תרשים 6). סנן את תמיסת הדוגמא דרך הפיפטה למבחנת תמ"ג , אם התמיסה נתקעת אפשר להשתמש בגומיה על מנת לדחוף אותה אל המבחנה.

מניעת זיהום מהפקק

הפקק של המבחינה עלולה לזהם את הדוגמה. אפילו פקק חדשה פולט חומרים (תרשם 7) במיוחד כאשר הממס הוא CDCl₃ או DMSO-d₆. כדי למנוע את זה מומלץ לסגור את המבחינה בסרט טפלון (תרשים 8) ואחר כך עם הפקק (תרשים 9). אין להפוך את המבחינה אלה יש לערבב בעזרת מערבל מערבולת (vortex mixer - תרשים 10) למשך דקה שלמה. אם התמיסה יותר צמיג ממים יידרש זמן ערבוב יותר ארוך.

דוגמאות רגישות לחמצן ובלחץ גבוה

במקרים מסוימים נדרשת סביבה אינרטית לדוגמא: הדוגמא רגישה לחמצן, החומר עלול להתחמצן. נמדדים זמני רלקסציה T₁ או T₂, החמצן שהוא מעט פארהמגנטי גורם להקטנה של זמן הרלקסציה האמיתי ולכן כדאי לבצע מדידה זו בסביבה נטולת חמצן. מחפשים אינטרקציות NOE וניתן לשפר את הרגישות על ידי סילוק החמצן.

הדרך הפשוטה ביותר לשמור על סביבה אינרטית היא להכין את הדוגמא תחת גז אינרטי לדוגמא ארגון או הליום ולמדוד את הספקטרום מיידית. יש לתאם מראש שליחת דוגמא כזו לשירות התמ"ג מכיוון שלא נוכל להתחייב לבצע זאת בזמן סביר. קיימות מבחנות תמ"ג מסחריות להכנת דוגמאות תמ"ג בואקום או בסביבה אינרטית, לדוגמא וילמד 528-JY. ניתן גם להכין את הדוגמא בוואקום על ידי הכנסה של צינור זכוכית אל מבחנת תמ"ג (תרשים 11) רגילה (חשוב לשמור על הצורה הגלילית של המבחנה במהלך ההדבקה).הדוגמא מוכנסת אל המבחנה ואז מחברים את המבחנה למערכת ואקום ושואבים ממנה את האויר. כדי לסלק את כל האויר יש להקפיא את הדוגמא לשאוב ולהפשיר ושוב להקפיא לשוב ולהפשיר עד שמגיעם ללחץ המתאים. סגירת המבחנה מתבצעת בלהבה (לחץ חלקי של גז אינרטי מקל על הסגירה).

למדידת דוגמאות בלחץ גבוה (עד 50 אטמוספרות) יש להשתמש במבחנות תמ"ג מתוצרת וילמד שמספרה 522-PP אם נדרש חימום של הדוגמא היא עלולה לרתוח ולעוף החוצה מהמבחנה. ניתן גם להשתמש במבחנת זכוכית אטומה וצרה שמוכנסת למבחנת תמ"ג רגילה, חתיכה קטנה של נייר בתחתית המבחנה החיצונית מפחיתה את הסיכוי לשבירת המבחנה הפנימית, בכל מקרה יש להשאיר נפח במבחנה הקטנה כדי לאפשר התפשטות של הדוגמא. יש לדעת שמדידה כזו כרוכה בהפסד רזולציה. יש לחסם את המבחנה הפנימית באופן נכון כדי למנוע את התפוצצותה בתוך הגלאי, (החיסום מתבצע על ידי חימום וקירור נשנה של הזכוכית על ידי שינוי טמפרטורת הלהבה) היות ופיצוץ כזה עלול להיות יקר מאוד. מסיבה זו יש לבקש רשות ממנהל המעבדה לפני שליחת דוגמה כזו לשירות התמ"ג או לפני מדידה עצמאית של דוגמה כזו.

הכנת דוגמאות לתמ"ג במצב מוצק וקשה למחצה

המבחינות ואביזריהן יקרות ומאוד קטנות. יש להיזהר לא לאבד או לפגוע בהם.

המבחנה לסיבוב בזווית הקסם (MAS) קטנה ולבנה (תרשים 12) ונקראת רוטור. ישנה שלושה סוגים עקריים של רוטורים: רוטור מלא של 80 מיקרוליטר המיועד לחומרים מוצקים ושל 50 ו-12 מקרוליטר לחומרים נוזליים יותר.

למדידת פרוטון בשיטת CRAMPS יש להשתמש ברוטור מיוחד ל-CRAMPS (תרשים 13).

לרוטורים של 50 ו-12 מיקרוליטר יש להשתמש בתותב (insert) המתאים (תרשים 14). התותבים מיוצרים משני חומרים, טפלון בצבע לבן וקֶל-אֶף שהוא שקוף.

בחר את חומר התותב לפי הסוספטיביליות (עֵרות) של החומר. אם הדיאמגנטיות של החומר גבוה כמו במים ובכלורופורם, השתמש בטפלון. אם הדיאמגנטיות נמוכה כמו באלכוהול, DMSO, ואצטון השתמש בקֶל-אֶף. התותבים מיועדים לחומרים רכים ונוזליים. אין להשתמש בתותב לחומר מוצק.

קיימים שלושה סוגים של פקקים (תרשים 14): השקוף (קֶל-אֶף) למדידות בטמפרטורות לא רחוקות מטמפרטורת החדר (‎–20°C‏ עד ‎50°C‏), והלבנים (בור ניטריד וזירקון) לטמפרטורות קיצוניות יותר מ-‎–80°C‏ עד ‎120°C‏. פקק הבור ניטריד שביר מאוד וכמעט לא ניתן לשימוש. הזירקון מומלץ לשימוש בטמפרטורה קיצונית מפני שהוא יותר עמיד מבור ניטריד. אם אין מספיק חומר מוצק אין להשתמש במבחנות מצומצמות, אלה מומלץ לדלל אותו עם חומר אי-אורגני כמו סיליקה, אלומין או גבס. המבחנות המצומצמות מיועדות לחומר רך או נוזלי בלבד. חומר קשה יפגע בתותבים.

יש להשתמש בכפפות כדי למנוע זיהום הדוגמה מהליפידים (שומנים) בעור שנותנים סיגנלים חזקים בתנאי סיבוב סביב ציר הקסם.

לחומר מוצק אין להשתמש בתותב. יש לטחון את הדוגמה במכתש ועלי לאבקה דקה (תרשים 15). העמד את המבחינה במעמד שלה והכנס את האבקה בשלבים בעזרת מרית (spatula) קטנה (תרשים 16). דחס את האבקה אחרי כל שלב בעזרת הקצה הארוך של הכלי המיועד לכך (תרשים 17). מלא את הרוטור עד מקום הפקק. אם הדוגמה מוכנה כמו שצריך היא אמורה להסתובב עד מהירות של 15 קילוהרץ.

לחומרים נוזליים ותקרישים (ג'לים) שימוש בתותב מפחית את הסיכוי של בועות המקשות על ה-shimming. אם צפיפות הנוזל ידוע ניתן לשקול את הרוטור, התותב, הבורג והפקק לפני המילוי ואת הרוטור הסגור אחרי המילוי כדי לבדוק שהוא מלא ללא בועות אוויר. בדוגמאות רכות כמו רקמות התותב ממקם את הדוגמה בדיוק במקום.

חומר נוזלי או חמרים שדרוש רק חימום קל להתיך אותו, יש להכניס אותו בעזרת פיפטה (פיפית) אוטומטית של 100 מיקרוליטר או במזרק (תרשים 18). אם משתמשים בתותב שים טיפה של הדוגמה בתחתית התותב ואם לא שים טיפה בתוך הפקק (תרשים 19).

לחומרים ביולוגיים כמו קרומי תא או חלבונים, השתמש ברוטור של 12 מיקרוליטר והוסף 5 עד 10% D₂O. העבר את הגלולית (pellet) לתחתית התא. ניתן להכניס את הרוטור בתוך מבחינת אפנדורף ולהשתמש בסרכזת (צנטריפוגה) מסוג swing-out כמו בתרשים 20 הוסף קצת של הנוזל העודף מהסרכוז. אם משתמשים בתותב שים טיפה של הנוזל העודף מהסרכוז בתחתית התותב ואם לא שים טיפה בתוך הפקק.

לתקרישים וגבישים נוזליים צמיגים הכנס את החומר בעזרת מזרק ו/או מרית. ניתן להשתמש בסרכזת להוריד את החומר למטה ולהוציא בועות.

לפולימרים, שרפים (resins) ודוגמאות תופחות אחרות, בדוק את מקדם התפיחה השייך לממס (ערך טיפוסי הוא 5). חשב את כמות הדוגמה המוצקה שנדרש כדי למלאות את הרוטור (12 או 50 מיקרוליטר) אחרי התפיחה. הכנס את המוצק לרוטור ותוסף קצת יותר ממס ממה שנדרש. ערבב עם סיכה. אם משתמשים בתותב שים טיפה של הממס בתחתית התותב ואם לא שים טיפה בתוך הפקק.

לאוכל ולרקמות, יש לשטוף ב-D₂O (תרשים 14). חתוך את הדוגמה בעזרת סכין מנתחים לגודל הנדרש (תרשים 21): ספרה בקוטר 2.84 מ"מ ל-12 מיקרוליטר וגליל בקוטר 2.95 מ"מ ואורך 7.3 מ"מ ל-50 מיקרוליטר. דוגמאות שטוחות כמו עלים ניתן לחתוך לגודל ולגלגל (תרשים 22). מלא את הרוטור ב-D₂O. שים טיפה של D₂O גם בתחתית התותב.

אם משתמשים בתותב הכנס אותו עם ההברגה למעלה. דחוף אותו פנימה עם הקצה הקצר (3 מ"מ) של כלי הדחיסה (תרשים 23). הכנסה עמוקה מדי עלולה להרוס את התותב (תרשים 24). הכנס את הבורג החרוץ בעזרת המברג המתאים (תרשימים 25-27). שימוש בזכוכית מגדלת (תרשים 28) עם תאורה יעזור. סובב את הבורג עד שתרגיש התנגדות. נקה את פתח הרוטור (תרשים 29) משאריות החומר בעזרת ממחטה (Kimwipe).

וודא שהפקק לא פגום (תרשים 30) לפני הכנסתו. אי אחידות של החומר או פקק פגום יכול להרוס את הרוטור (תרשים 31) ואת הגלאי. הכנס את הפקק (תרשים 32) עד הסוף. חשוב לבדוק שהפקק לא פגום ושהפקק לא יהיה משוחרר וניתן ללחוץ על הפקק עם כלי רך כלשהו (תרשים 33).

פירוק וניקוי דוגמאות מוצקות וקשות למחצה

בשלב הפירוק והשטיפה יש להיזהר מאוד לא לאבד את החלקים.

הוצא את הפקק. בפקק קֶל-אֶף כדאי להוציא אותו על ידי קירור הרוטור כדי להפחית את הסיכוי לפגום אותו. אם נזהרים לא לקבל כוויות קור ולפתוח את הברז הנכון, ניתן להשתמש באַוָּר (vent) של בלון חנקן נוזלי (תרשים 40). כאשר הרוטור קר ניתן להוציא את הפקק בקלות עם היד. לפקקים של בור ניטריד וזירקון השתמש בכלי המיועד להוצאת הפקק. צריכים להכניס את הסכין של הכלי בחריץ בין ראש הרוטור והפקק (תרשים 35). שימוש לא נכון עלול להרוס את הפקק (תרשים 30).

הוצא את התותב אם יש. הכנס את במברג המיוחד (מומלץ להשתמש בזכוכית מגדלת – תרשים 28) והוצא את בורג החרוץ בהברגה החוצה (תרשים 36). הכנס את בורג המתכת המיוחד (אל תשתמש בבורג אחר מפני שהבורג לא בתקן רגיל ובורג רגיל יהרוס את התותב) עד שמרגישים התנגדות ומשוך את התותב החוצה (תרשים 37).

אם החומר מוצק או חצי מוצק הוצא אותו מהרוטור בעזרת מרית (תרשים 38). שטוף את הרוטור, הפקק, התותב, בורג החרוץ והכלים במים מזוקקים באצטון ואם צריך בממס אחר (תרשים 39). הכנס את כל החלקים באצטון לאמבט קול על-שמעי (ultrasound bath) והפעל למשך שלוש דקות (תרשים 40). יבש את החלקים בממחטות מסוג Kimwipe (תרשים 41) ואחר כך בתנור ב-65°C (ולא יותר, אחרת תהרוס את התותבים ואת הפקקים) למשך 20 דקות (תרשים 42).